Diketopiperazin und Pyroglutamat: Abbauprodukte am N-Terminus

Der N-Terminus einer Peptidkette trägt eine freie Aminogruppe, und diese Gruppe ist reaktiv. Unter bestimmten Bedingungen greift sie Bindungen im eigenen Molekül an und bildet einen Ring. Zwei solcher Reaktionen spielen in der Peptidanalytik eine wichtige Rolle: die Bildung von Pyroglutamat und die Bildung von Diketopiperazinen. Beide verändern das Molekül, beide erzeugen charakteristische Signale im Massenspektrum, und beide lassen sich an der Sequenz vorhersagen.

Pyroglutamat: der Ring am Kettenanfang

Steht am N-Terminus ein Glutamin, kann dessen Seitenketten-Amid mit der freien Aminogruppe desselben Rests reagieren. Es entsteht ein fünfgliedriger Lactamring, das Pyroglutamat (pGlu), und Ammoniak wird frei. Die Masse sinkt um 17,03 Da. Mit einer N-terminalen Glutaminsäure ist dieselbe Reaktion möglich, dabei wird Wasser abgespalten (−18,01 Da); sie verläuft aber deutlich langsamer.

Die Reaktion hat drei Folgen:

• Die positive Ladung am N-Terminus verschwindet, weil die freie Aminogruppe Teil des Rings wird. Das Produkt ist weniger basisch und in der Umkehrphasen-HPLC meist etwas später eluierend.
• Der N-Terminus ist blockiert. Klassische Sequenzierung nach Edman funktioniert nicht mehr, und aminreaktive Markierungen greifen nicht.
• Die Reaktion ist praktisch irreversibel.

In der Natur ist Pyroglutamat eine gewollte Modifikation: Das Gonadotropin-Releasing-Hormon beginnt damit. Auch ARA-290 (Cibinetid) wird in der Literatur als Pyroglutamat-Form pGlu-EQLERALNSS beschrieben; die Summenformel C51H84N16O21 mit 1257,32 g/mol entspricht genau dieser Form, die offene Glutamin-Form wäre C51H87N17O21. Bei solchen Materialien ist das offene Glutamin die Abweichung, nicht der Ring. Wie natürliche Peptidhormone solche Modifikationen nutzen, beschreibt Peptidhormone: Beispiele und Strukturmerkmale.

Bei Peptiden, deren Sequenz mit einem freien Glutamin beginnen soll, ist die Pyroglutamatbildung dagegen ein Abbauweg. Sie beschleunigt sich mit Wärme, in schwach sauren bis neutralen Lösungen und in bestimmten Puffern — und läuft langsam auch im gelagerten Lyophilisat ab.

Diketopiperazin: zwei Reste fallen ab

Beim Diketopiperazin greift die N-terminale Aminogruppe nicht die eigene Seitenkette an, sondern die zweite Peptidbindung der Kette. Die ersten beiden Aminosäuren schließen sich zu einem sechsgliedrigen Ring zusammen und werden dabei vom Rest der Kette abgetrennt. Zurück bleiben zwei Moleküle: das zyklische Dipeptid und ein um zwei Reste verkürztes Peptid.

Für die Anfälligkeit entscheidend ist die Sequenz am Kettenanfang:

• Prolin an Position 2 ist das stärkste Warnsignal. Die Ringstruktur des Prolins begünstigt eine Geometrie der Peptidbindung, die den Ringschluss erleichtert.
• Glycin an Position 1 oder 2 macht die Kette beweglich und fördert die Reaktion ebenfalls.
• Neutraler bis basischer pH-Wert beschleunigt, weil die Aminogruppe dann unprotoniert und damit reaktiv ist.

Ein Beispiel aus dem Katalog ist KPV mit der Sequenz Lys-Pro-Val: Prolin steht an Position 2. Bei einem Tripeptid bedeutet eine Diketopiperazinbildung, dass vom Material nur noch das zyklische Dipeptid aus Lysin und Prolin und ein einzelnes Valin übrig bleiben. Gelöstes KPV sollte deshalb leicht sauer und kalt gelagert und nicht lange bei neutralem pH stehen gelassen werden.

Diketopiperazinbildung ist außerdem eine bekannte Nebenreaktion der Festphasensynthese: Auf der Stufe des harzgebundenen Dipeptids kann sich der Ring bilden und das Dipeptid vom Harz lösen. Das Ergebnis ist ein Syntheseprodukt, dem die beiden C-terminalen Reste fehlen; siehe Festphasensynthese.

Erkennen im Spektrum und im Chromatogramm

Beide Reaktionen hinterlassen eindeutige Spuren:

Reaktion	Massenänderung	Chromatographisches Verhalten
Pyroglutamat aus Gln	−17,03 Da	meist späterer Nebenpeak
Pyroglutamat aus Glu	−18,01 Da	meist späterer Nebenpeak
Diketopiperazin	Verlust der Masse der ersten beiden Reste abzüglich Wasser; zusätzlich ein kleines zyklisches Dipeptid	verkürztes Peptid meist früher eluierend, Dipeptid sehr früh

Ein Signal bei −17 Da ist bei Peptiden mit N-terminalem Glutamin fast immer Pyroglutamat. Vorsicht bei der Interpretation: Auch der Verlust von Ammoniak in der Ionenquelle des Massenspektrometers erzeugt −17-Da-Signale. Ob es sich um eine echte Verunreinigung handelt, zeigt die Chromatographie — ein echtes Abbauprodukt hat eine eigene Retentionszeit, ein In-Source-Fragment nicht. Wie man solche Signale zuordnet, beschreibt Massenspektrum interpretieren; die übrigen typischen Nebenprodukte stehen in Nebenpeaks im Chromatogramm.

Vorbeugung

• Anfällige Sequenzen anhand der ersten zwei bis drei Reste identifizieren: N-terminales Gln oder Glu, Pro oder Gly an Position 2.
• Lyophilisat trocken und bei −20 °C lagern.
• Lösungen leicht sauer und kalt halten, nur kurz bei neutralem oder basischem pH arbeiten.
• Stammlösungen aliquotieren statt wiederholt zu entnehmen; siehe Aliquotieren statt wiederholt auftauen.

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