Peptidpools in der Immunologie: überlappende Pools richtig aufbauen

Wer wissen will, welche Abschnitte eines Proteins von T-Zellen erkannt werden, kann nicht jedes denkbare Epitop einzeln synthetisieren. Die etablierte Lösung ist ein Peptidpool: eine Mischung kurzer, überlappender Peptide, die die gesamte Proteinsequenz lückenlos abdecken. Dieser Beitrag beschreibt, wie solche Pools aufgebaut werden, wie man sie löst und wo die typischen Fehlerquellen liegen.

Warum Pools und nicht einzelne Peptide

T-Zellen erkennen keine ganzen Proteine, sondern kurze Bruchstücke, die von MHC-Molekülen an der Zelloberfläche präsentiert werden. MHC-Klasse-I-Moleküle binden typischerweise Peptide mit 8 bis 10 Aminosäuren, MHC-Klasse-II-Moleküle längere Peptide mit etwa 13 bis 25 Resten, deren Enden aus der Bindungsfurche herausragen. Welches Stück eines Proteins tatsächlich präsentiert wird, hängt vom MHC-Typ ab und lässt sich nur begrenzt vorhersagen.

Ein überlappender Pool umgeht dieses Problem: Er bietet jeden möglichen Abschnitt des Proteins an, und die Zellen „wählen“ selbst. Ausgelesen wird typischerweise über Zytokinfreisetzung, etwa im ELISpot-Verfahren oder durch intrazelluläre Färbung in der Durchflusszytometrie.

Das Standarddesign: 15-mere, 11 Reste Überlappung

Das am weitesten verbreitete Format sind Peptide aus 15 Aminosäuren, die sich jeweils um 11 Reste überlappen. Jedes folgende Peptid ist also um 4 Positionen verschoben. Die Überlegung dahinter:

• 15 Reste sind lang genug für MHC-Klasse-II und können in Zellkultur für MHC-Klasse-I auf die passende Länge zurechtgeschnitten werden.
• 11 Reste Überlappung garantieren, dass jedes zusammenhängende Stück von bis zu 11 Aminosäuren in mindestens einem Peptid vollständig enthalten ist.

Die Zahl der benötigten Peptide ergibt sich aus der Proteinlänge: näherungsweise (Länge − 15) / 4 + 1. Für ein Protein mit 400 Aminosäuren sind das rund 97 Peptide, für 1000 Aminosäuren rund 247. Für sehr lange Proteine wird die Sequenz auf mehrere Subpools aufgeteilt.

Matrixpools zur Eingrenzung

Reagiert ein Pool, weiß man, dass ein Epitop darin steckt — aber nicht, welches Peptid es trägt. Um nicht jedes Peptid einzeln testen zu müssen, werden Matrixpools verwendet: Die Peptide werden gedanklich in einem Raster angeordnet, und jede Zeile sowie jede Spalte bildet einen eigenen Pool. Jedes Peptid ist damit in genau zwei Pools vertreten. Reagieren eine Zeile und eine Spalte, ist das Peptid am Kreuzungspunkt der Kandidat, der dann einzeln bestätigt wird.

Lösen und Konzentration

Die Peptide eines Pools unterscheiden sich stark in ihrer Löslichkeit: Manche Abschnitte eines Proteins sind hydrophob, andere stark geladen. Bewährt hat sich folgendes Vorgehen:

1. Stammlösung in DMSO. Die meisten Peptide lösen sich in reinem DMSO gut. Der Pool wird hochkonzentriert angesetzt.
2. Verdünnung ins Medium. Unmittelbar vor dem Einsatz in Kulturmedium verdünnen. Die DMSO-Endkonzentration sollte so niedrig sein, dass sie die Zellen nicht beeinflusst, üblicherweise unter einem Prozent. Grenzen und Tücken beschreibt DMSO als Lösungsvermittler.
3. Konzentration je Peptid angeben. Üblich ist eine Endkonzentration im Bereich von etwa 1 bis 2 µg/ml je Peptid. Bei einem Pool aus 100 Peptiden bedeutet das eine Gesamtpeptidkonzentration von 100 bis 200 µg/ml — und entsprechend mehr DMSO. Die Angabe „je Peptid“ gehört deshalb immer ins Protokoll.

Stammlösungen werden aliquotiert und bei −20 °C oder −80 °C gelagert; Peptide mit Cystein oder Methionin oxidieren in DMSO-Lösung mit der Zeit; siehe Aliquotieren statt wiederholt auftauen.

Reinheit: roh, entsalzt oder gereinigt

Peptide für Pools werden oft in geringerer Reinheit eingesetzt als Einzelpeptide, weil sonst Kosten und Aufwand explodieren. Das ist vertretbar, hat aber Folgen, die man kennen sollte:

• Trunkierte Nebenprodukte sind ebenfalls Peptide aus der Zielsequenz und können selbst Epitope tragen. Sie verfälschen das Ergebnis selten, erschweren aber die exakte Zuordnung.
• Kreuzkontamination zwischen Pools, etwa durch gemeinsam genutzte Syntheseschritte, kann falsch positive Reaktionen erzeugen.
• Rückstände aus der Synthese — TFA, Scavenger, Lösungsmittel — können in empfindlichen Zellassays stören, besonders bei hoher Gesamtpeptidkonzentration.

Wo eine Reaktion auf ein einzelnes Peptid bestätigt werden soll, lohnt sich deshalb ein Nachtest mit gereinigtem Einzelpeptid.

Kontrollen

Ein Pool-Experiment ist nur so aussagekräftig wie seine Kontrollen: ein Negativansatz mit derselben DMSO-Konzentration ohne Peptid, eine Positivkontrolle mit einem unspezifischen Stimulans und idealerweise ein Pool mit bekannter Reaktivität als Vergleich. Den allgemeinen Rahmen beschreibt Kontrollen im Versuchsaufbau; Zellmodelle für die Peptidforschung stellt Zellkulturmodelle für Peptidforschung vor.

Research Use Only. Alle im Katalog geführten Materialien sind ausschließlich für die wissenschaftliche Laborforschung bestimmt und nicht zur Anwendung am oder im menschlichen oder tierischen Körper bestimmt.