Probenvorbereitung für die HPLC

Ein sauberes Chromatogramm beginnt nicht am Probenaufgabeventil, sondern bei der Probenvorbereitung. Unsachgemäße Vorbereitung erzeugt Artefakte, die sich später kaum von echten Verunreinigungen der Substanz selbst unterscheiden lassen.

Partikelfreiheit als Grundvoraussetzung

Feste Partikel in einer Probe können die HPLC-Säule verstopfen oder beschädigen und den Systemdruck unkontrolliert ansteigen lassen — eine Filtration der Probe durch eine feinporige Membran, meist 0,2 bis 0,45 Mikrometer, vor der Probenaufgabe ist deshalb Standardpraxis, unabhängig davon, ob die Probe optisch klar erscheint.

Auch scheinbar klare Lösungen können submikroskopische Partikel enthalten, die visuell nicht erkennbar sind, sich aber auf der Säule ablagern und über viele Probenaufgaben hinweg die Trennleistung schleichend verschlechtern können.

Lösungsmittelkompatibilität mit der mobilen Phase

Die Probe sollte möglichst im selben oder einem mit der mobilen Phase kompatiblen Lösungsmittel vorliegen — ein starker Unterschied in der Lösungsmittelstärke zwischen Probe und mobiler Phase kann zu Peakverbreiterung oder -verzerrung direkt am Säulenanfang führen, unabhängig von der eigentlichen Reinheit der Substanz.

Bei Proben aus einer DMSO-Stammlösung ist besondere Vorsicht geboten: Ein zu hoher DMSO-Anteil in der finalen, zur Probenaufgabe vorgesehenen Lösung kann die Trennung verschlechtern und sollte durch ausreichende Verdünnung mit einem mit der mobilen Phase kompatiblen Lösungsmittel reduziert werden.

Konzentration im richtigen Arbeitsbereich

Eine zu konzentrierte Probe kann den Detektor übersteuern und zu einem verzerrten, nicht mehr linear auswertbaren Signal führen, während eine zu stark verdünnte Probe im Rauschen des Detektors verschwindet — beide Extreme liefern ein Chromatogramm, das die tatsächliche Zusammensetzung der Probe nicht korrekt wiedergibt.

Eine Verdünnungsreihe vor der eigentlichen Analyse hilft, den optimalen Konzentrationsbereich für die jeweilige Methode empirisch zu ermitteln, statt sich auf eine pauschale Konzentration zu verlassen, die für andere Substanzen oder Methoden geeignet war.

Vermeidung von Kontamination während der Vorbereitung

Wiederverwendete Gefäße oder Pipettenspitzen können Spuren vorheriger Proben übertragen und im Chromatogramm als unerklärliche zusätzliche Peaks erscheinen — Einwegmaterial oder gründliche Reinigung zwischen unterschiedlichen Proben vermeidet diese Fehlerquelle zuverlässig.

Auch die Reihenfolge der Probenvorbereitung mehrerer unterschiedlicher Substanzen an einem Arbeitsplatz sollte durchdacht sein — von der niedrigsten zur höchsten erwarteten Konzentration zu arbeiten reduziert das Risiko einer Verschleppung zwischen Proben gegenüber der umgekehrten Reihenfolge.

Woran sich das im Katalog ablesen lässt

Der Katalog führt derzeit 69 Referenzmaterialien in 9 Materialgruppen, mit 122 einzeln dokumentierten Chargen. Für jede dieser Chargen ist eine eigene Seite erreichbar, die Prüfmethode, Messwert, Spezifikation und Prüfdatum je Parameter ausweist — ohne Konto und vor der Kaufentscheidung einsehbar.

Bei 44 der 69 Materialien sind CAS-Nummer, Summenformel, Molekülmasse und Sequenz gegen öffentliche chemische Datenbanken abgeglichen. Die übrigen sind gekennzeichnet, weil sich mindestens ein Referenzwert dort nicht eindeutig belegen lässt — bei Gemischen, Polypeptidfraktionen und rekombinanten Proteinen ist das der Normalfall. Eine Kennzeichnung ist hier die ehrlichere Angabe als eine Zahl, die niemand nachprüfen kann.

Einordnung

Sorgfältige Probenvorbereitung ist die Voraussetzung dafür, dass ein Chromatogramm die tatsächliche Probe zeigt und nicht Artefakte der Handhabung. Partikelfreiheit, Lösungsmittelkompatibilität und die richtige Konzentration sind dabei die drei zentralen Stellschrauben, die über ein sauberes oder ein irreführendes Ergebnis entscheiden.

Research Use Only. Alle im Katalog geführten Materialien sind ausschließlich für die wissenschaftliche Laborforschung bestimmt. Sie sind keine Arzneimittel, keine Lebensmittel und keine Kosmetika und nicht zur Anwendung am oder im menschlichen oder tierischen Körper bestimmt.