BCA und Bradford bei Peptiden: warum die Proteinbestimmung täuscht

Im Proteinlabor gehören der Bradford- und der BCA-Test zur Routine: Probe zugeben, Farbe entwickeln lassen, gegen eine BSA-Standardreihe ablesen. Für Peptide übernehmen viele dieses Vorgehen unverändert — und erhalten Konzentrationen, die um ein Vielfaches danebenliegen können. Dieser Beitrag erklärt, warum die beiden Farbtests bei Peptiden täuschen und welche Methoden besser geeignet sind.

Das gemeinsame Problem: der Standard

Beide Tests sind relative Verfahren. Sie messen eine Farbreaktion und rechnen sie über eine Standardkurve in eine Konzentration um. Der übliche Standard ist Rinderserumalbumin (BSA), ein Protein mit 583 Aminosäuren und einer ausgewogenen Zusammensetzung. Das Ergebnis stimmt nur dann, wenn die Probe pro Mikrogramm genauso stark reagiert wie BSA.

Bei Proteinen mit durchschnittlicher Zusammensetzung ist das näherungsweise erfüllt. Ein kurzes Peptid hat aber keine durchschnittliche Zusammensetzung: Ein Hexapeptid mit drei aromatischen Resten reagiert völlig anders als ein Pentadecapeptid mit fünf Prolinen und keinem einzigen Aromaten. Genau darin liegt die Fehlerquelle.

Bradford: abhängig von Größe und Sequenz

Beim Bradford-Test bindet der Farbstoff Coomassie Brilliant Blue G-250 an Proteine und verschiebt dabei sein Absorptionsmaximum von etwa 465 nm nach 595 nm. Die Bindung erfolgt überwiegend an Arginin, in geringerem Maß an Lysin, Histidin und aromatische Reste, und sie setzt eine gewisse Molekülgröße voraus.

Für Peptide folgen daraus zwei Probleme:

• Größenschwelle. Peptide unterhalb von etwa 3 kDa erzeugen oft kaum ein Signal, weil der Farbstoff an so kleine Moleküle schlecht bindet.
• Sequenzabhängigkeit. Ein argininreiches Peptid färbt stark, ein argininfreies schwach. Das Signal pro Mikrogramm kann zwischen zwei Peptiden gleicher Masse um ein Vielfaches schwanken.

Für die meisten kurzen Forschungspeptide ist der Bradford-Test damit keine geeignete Methode zur Konzentrationsbestimmung.

BCA: weniger sequenzabhängig, aber nicht frei davon

Der BCA-Test beruht auf zwei Schritten: Peptidbindungen reduzieren in alkalischer Lösung Kupfer(II) zu Kupfer(I), und Bicinchoninsäure bildet mit Kupfer(I) einen violetten Komplex, gemessen bei 562 nm. Weil die Reaktion am Rückgrat ansetzt, ist sie weniger sequenzabhängig als der Bradford-Test.

Allerdings reduzieren auch die Seitenketten von Cystein, Tyrosin und Tryptophan Kupfer stark. Ein kurzes Peptid mit mehreren dieser Reste liefert deshalb deutlich mehr Signal pro Mikrogramm als BSA, ein Peptid ohne sie deutlich weniger. Hinzu kommen störende Stoffe:

• Reduktionsmittel wie DTT oder Mercaptoethanol,
• Chelatoren wie EDTA,
• Kupferkomplexe in der Probe selbst — bei GHK-Cu oder den Blends GLOW und KLOW bringt die Probe ihr eigenes Kupfer mit und verfälscht die Reaktion grundlegend.

Die eigentliche Frage: Einwaage oder Konzentration?

Oft wird ein Farbtest eingesetzt, um eine Stammlösung zu „kontrollieren“, die aus einer bekannten Einwaage angesetzt wurde. Dabei gehen zwei verschiedene Größen durcheinander. Ein Lyophilisat enthält neben dem Peptid Gegenionen und Restwasser; der Peptidgehalt pro Milligramm Einwaage liegt deshalb meist deutlich unter 100 Prozent. Ein Farbtest, der gegen BSA kalibriert ist, beantwortet diese Frage aber nicht besser als die Einwaage — er fügt nur einen weiteren, sequenzabhängigen Fehler hinzu. Den Unterschied erklärt Peptidgehalt und Reinheit sind nicht dasselbe.

Bessere Alternativen

Methode	Prinzip	Stärken	Grenzen
Aminosäureanalyse	Hydrolyse und Quantifizierung der Aminosäuren	absolut, unabhängig vom Standardprotein	aufwendig, zerstört die Probe
UV bei 280 nm	Absorption von Tryptophan und Tyrosin	schnell, probenschonend, Extinktionskoeffizient aus der Sequenz berechenbar	nur mit aromatischen Resten, empfindlich gegen Streulicht
UV bei 205–215 nm	Absorption der Peptidbindung	auch ohne Aromaten	viele Puffer und Lösungsmittel absorbieren mit
Quantitative HPLC	Peakfläche gegen Referenzstandard	spezifisch für das intakte Peptid	braucht einen charakterisierten Standard desselben Peptids

Die Aminosäureanalyse ist der Referenzweg für eine absolute Gehaltsbestimmung; siehe Aminosäureanalyse als unabhängige Gehaltsbestimmung. Für den Laboralltag ist die UV-Absorption bei 280 nm meist der pragmatische Weg, sofern die Sequenz Tryptophan oder Tyrosin enthält; die Rechenschritte beschreibt UV-Quantifizierung bei 280 nm.

Wenn es doch ein Farbtest sein soll

Wer aus praktischen Gründen bei BCA bleibt, sollte als Standard nicht BSA, sondern das Peptid selbst verwenden, dessen Gehalt auf anderem Weg bestimmt wurde. Dann kürzt sich die Sequenzabhängigkeit heraus, und der Test wird zu einem brauchbaren relativen Vergleich zwischen Proben desselben Peptids. Den Standard und die Verdünnungsreihe dokumentiert man wie jede Kalibrierung; siehe Verdünnungsreihen sauber ansetzen.

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