Kleine Peptide im Gel: Tricine-SDS-PAGE statt Laemmli

Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist im Proteinlabor so selbstverständlich, dass man sie auch für Peptide in Betracht zieht. Mit dem klassischen Gelsystem nach Laemmli ist das Ergebnis bei kleinen Molekülen jedoch meist enttäuschend: eine verschmierte Bande am unteren Gelrand. Das Tricine-System wurde genau für diesen Größenbereich entwickelt. Dieser Beitrag erklärt, warum es funktioniert, wie man es einsetzt und wann ein Gel die falsche Methode ist.

Das Problem mit Glycin

Im Laemmli-System wird die Probe zunächst in einem Sammelgel zu einer schmalen Zone konzentriert. Der Trick dabei: Chlorid-Ionen wandern schnell voraus, Glycin-Ionen folgen langsam, und die SDS-beladenen Proteine werden dazwischen zu einem scharfen Stapel zusammengeschoben. Im Trenngel ändert sich der pH-Wert, Glycin wird schneller, überholt die Proteine, und diese trennen sich nach Größe.

Für große Proteine funktioniert das hervorragend. Kleine SDS-Peptid-Komplexe dagegen sind so beweglich, dass sie sich kaum von der Glycin-Front und den mitwandernden SDS-Mizellen lösen. Unterhalb von etwa 10 bis 15 kDa verlieren Laemmli-Gele deshalb rasch an Trennleistung.

Die Lösung: Tricine als Folgeion

1987 beschrieben Hermann Schägger und Gebhard von Jagow ein System, in dem Tricine das Glycin als Folgeion im Laufpuffer ersetzt. Tricine wandert unter den Gelbedingungen deutlich schneller als Glycin. Die Folge: Kleine Peptide lösen sich früher aus dem Stapel, werden von den SDS-Mizellen getrennt und im Trenngel nach Größe aufgetrennt. Mit geeigneten Gelkonzentrationen trennt das System Moleküle ab etwa 1 kDa und bis in den Bereich von rund 100 kDa.

Typische Merkmale eines Tricine-Gels:

• Höhere Acrylamidkonzentration im Trenngel für kleine Peptide, oft um 16 Prozent, mit erhöhtem Vernetzeranteil.
• Optionales Zwischengel zwischen Sammel- und Trenngel, das die Bandenschärfe im niedrigen Massenbereich verbessert.
• Getrennte Anoden- und Kathodenpuffer mit Tricine im Kathodenpuffer.
• Passender Größenstandard mit Markern im Bereich von wenigen Kilodalton.

Fixieren und Färben: wo kleine Peptide verloren gehen

Das häufigste Problem bei Peptidgelen tritt nicht bei der Trennung auf, sondern danach. Kleine Peptide sind im Gel beweglich und werden bei den üblichen Fixier-, Färbe- und Entfärbeschritten leicht ausgewaschen. Bewährt haben sich:

• eine gründliche Fixierung, etwa mit Methanol-Essigsäure-Gemischen, bei sehr kleinen Peptiden auch mit Glutaraldehyd, das die Peptide im Gel vernetzt,
• kurze Entfärbezeiten,
• empfindlichere Färbungen wie Silberfärbung, weil Coomassie bei kleinen Mengen kurzer Peptide an seine Nachweisgrenze stößt.

Für einen Western Blot gilt Entsprechendes: Kleine Peptide wandern leicht durch die Membran hindurch. Membranen mit 0,2 µm Porengröße und verkürzte Transferzeiten reduzieren den Verlust.

Grenzen: wann ein Gel die falsche Methode ist

So nützlich das Tricine-System ist, es hat klare Grenzen, die man ehrlich benennen sollte:

• Unregelmäßige SDS-Bindung. Große Proteine binden SDS in einem recht konstanten Verhältnis zu ihrer Masse; deshalb wandern sie nach Größe. Kurze Peptide weichen davon ab — abhängig von Ladung, Hydrophobie und Modifikationen. Ihre Laufhöhe entspricht oft nicht der tatsächlichen Masse.
• Auflösung. Ein Gel trennt nach Größe, nicht nach chemischen Details. Eine Deletion eines einzelnen Rests, eine Oxidation oder eine Deamidierung verändert die Laufhöhe eines 4-kDa-Peptids nicht erkennbar.
• Quantifizierung. Bandenintensitäten nach Färbung sind nur grob quantitativ.

Für die meisten synthetischen Peptide in unserem Katalog, die unterhalb von 5 kDa liegen, sind deshalb Umkehrphasen-HPLC und Massenspektrometrie die Methoden der Wahl; siehe HPLC und LC-MS. Das Gel spielt seine Stärken bei größeren Materialien aus: rekombinanten Proteinen wie Follistatin-344 (rund 38 kDa) und ACE-031 (rund 78 kDa), bei denen es Abbauprodukte und Aggregate anzeigt, die sich per HPLC schwerer beurteilen lassen. Den Unterschied zwischen rekombinanter und synthetischer Herstellung beschreibt Rekombinant oder synthetisch hergestellt.

Wo die Grenze zwischen Peptid und Protein in Bezug auf Größe und Analytik verläuft, erklären die Beiträge Molekülmasse, Kettenlänge und Molekülgröße und Peptid oder Protein.

Research Use Only. Alle im Katalog geführten Materialien sind ausschließlich für die wissenschaftliche Laborforschung bestimmt und nicht zur Anwendung am oder im menschlichen oder tierischen Körper bestimmt.