Kapillarelektrophorese: die orthogonale Reinheitsprüfung für Peptide

Die Reinheitsangabe eines Peptids beruht fast immer auf einer einzigen Methode: der Umkehrphasen-HPLC. Das ist ein bewährter Standard, hat aber eine prinzipielle Schwäche. Verunreinigungen, die sich in ihrer Hydrophobie kaum vom Hauptprodukt unterscheiden, laufen mit ihm zusammen und verschwinden im Hauptpeak. Die Kapillarelektrophorese (CE) trennt nach einem ganz anderen Prinzip und macht solche Verunreinigungen häufig sichtbar. Dieser Beitrag erklärt, wie.

Das Prinzip

Die Kapillarelektrophorese findet in einer dünnen Quarzglaskapillare statt, typischerweise 25 bis 75 Mikrometer Innendurchmesser und einige zehn Zentimeter lang, gefüllt mit einem Puffer. Beide Enden tauchen in Puffergefäße, zwischen denen eine Hochspannung von bis zu 30 Kilovolt anliegt. Die Probe wird als winziger Pfropfen am Anfang der Kapillare aufgegeben.

Zwei Kräfte bewegen die Moleküle:

• Elektrophoretische Wanderung. Geladene Moleküle wandern im elektrischen Feld zum entgegengesetzt geladenen Pol. Wie schnell, hängt vom Verhältnis ihrer Ladung zu ihrer Größe ab: Kleine, stark geladene Moleküle wandern schnell, große, schwach geladene langsam.
• Elektroosmotischer Fluss. Die Innenwand der Quarzkapillare ist negativ geladen und zieht positive Ionen aus dem Puffer an. Im elektrischen Feld wandern diese zur Kathode und ziehen die gesamte Flüssigkeit mit. Dieser Fluss transportiert alle Probenbestandteile — auch neutrale — am Detektor vorbei.

Das Ergebnis ist ein Elektropherogramm, das auf den ersten Blick einem Chromatogramm ähnelt: Peaks über der Zeit, Flächen proportional zur Menge.

Warum das die HPLC ergänzt

Die Umkehrphasen-HPLC trennt nach Hydrophobie. Zwei Peptide, die gleich hydrophob, aber unterschiedlich geladen sind, trennt sie schlecht. Die CE trennt nach Ladung und Größe — und genau solche Paare trennt sie gut. Man nennt die beiden Methoden deshalb orthogonal: Sie schauen aus verschiedenen Richtungen auf dieselbe Probe.

Typische Fälle, in denen die CE mehr sieht als die HPLC:

• Deamidierung. Aus einem Asparagin wird eine Asparaginsäure; die Hydrophobie ändert sich kaum, die Ladung um eine ganze Einheit. Die CE trennt Ausgangspeptid und Produkt meist deutlich; siehe Deamidierung.
• Fehlende oder zusätzliche basische Reste. Eine Deletion eines Lysins verändert die Ladung stärker als die Hydrophobie.
• Veränderte Kettenenden. Eine fehlende Acetylierung am N-Terminus oder eine freie Säure statt eines Amids am C-Terminus verändert die Ladung und fällt in der CE auf.
• Gegenionen und kleine Ionen. Mit geeigneten Bedingungen lassen sich auch Acetat, Trifluoracetat oder Chlorid bestimmen.

Varianten der Methode

Unter dem Oberbegriff Kapillarelektrophorese laufen mehrere Verfahren:

Variante	Trennprinzip	Einsatz bei Peptiden
Kapillarzonenelektrophorese (CZE)	Ladung-zu-Größe in freier Lösung	Reinheit, Ladungsvarianten
Kapillar-isoelektrische Fokussierung (cIEF)	isoelektrischer Punkt in einem pH-Gradienten	Ladungsvarianten größerer Peptide und Proteine
Kapillar-Gelelektrophorese (CGE)	Größe in einem Siebmedium	größere Peptide und Proteine
Mizellare elektrokinetische Chromatographie (MEKC)	Verteilung in Mizellen	neutrale und hydrophobe Moleküle

Für die Reinheitsprüfung kurzer bis mittellanger Peptide ist die CZE die gebräuchlichste Variante. Wie der isoelektrische Punkt aus der Sequenz folgt, beschreibt der Beitrag Der isoelektrische Punkt.

Grenzen

Die CE hat auch Schwächen, die ihren Einsatz als alleinige Reinheitsmethode begrenzen:

• Empfindlichkeit. Die Probenmenge und der optische Weg durch die dünne Kapillare sind winzig. Die Nachweisgrenze liegt deshalb bei UV-Detektion meist höher als in der HPLC.
• Wandadsorption. Stark basische Peptide haften an der negativ geladenen Kapillarwand. Beschichtete Kapillaren oder stark saure Puffer schaffen Abhilfe, verändern aber die Trennung.
• Reproduzierbarkeit der Migrationszeiten. Der elektroosmotische Fluss reagiert empfindlich auf den Zustand der Kapillarwand. Relative Migrationszeiten und interne Standards sind deshalb üblich.
• Kopplung an die Massenspektrometrie ist möglich, aber technisch anspruchsvoller als bei der LC-MS.

Was das für die Bewertung eines Materials bedeutet

Eine einzelne HPLC-Reinheitsangabe ist eine Aussage aus einer Perspektive. Wo es auf die Reinheit besonders ankommt — etwa bei der Etablierung einer Methode oder bei einem Material, dessen Abbauprodukte ladungsverändert sind —, ist eine orthogonale Methode wie die CE ein sinnvoller zweiter Blick. Was die HPLC-Prozentzahl allein aussagt, beschreibt der Beitrag HPLC-Reinheit verstehen.

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