Deamidierung von Asparagin und Glutamin: Mechanismus, Nachweis, Vorbeugung

Deamidierung ist einer der häufigsten chemischen Abbauwege von Peptiden, und einer der tückischsten, weil sie im Massenspektrum kaum auffällt. Ein Peptid verliert dabei keinen Rest und gewinnt keinen hinzu; eine einzige Seitenkette ändert ihre Funktion. Dieser Beitrag erklärt, was dabei chemisch passiert, welche Sequenzen anfällig sind und wie sich der Abbau nachweisen lässt.

Was chemisch passiert

Asparagin (Asn, N) und Glutamin (Gln, Q) tragen in ihrer Seitenkette eine Amidgruppe. Bei der Deamidierung wird diese Amidgruppe in eine Carboxylgruppe umgewandelt; dabei wird Ammoniak frei. Aus Asparagin wird eine Asparaginsäure, aus Glutamin eine Glutaminsäure.

Bei Asparagin verläuft die Reaktion unter neutralen und basischen Bedingungen überwiegend über einen ringförmigen Zwischenzustand, ein Succinimid. Dieser Ring öffnet sich anschließend auf zwei Wegen: Es entsteht normale Asparaginsäure — oder Isoasparaginsäure, bei der die Kette über das „falsche“ Kohlenstoffatom weiterläuft. Isoasparaginsäure entsteht dabei typischerweise im Überschuss. Das Succinimid kann außerdem racemisieren, sodass auch D-Formen auftreten.

Für ein Referenzmaterial heißt das: Aus einem einzigen Asparaginrest können mehrere verschiedene Abbauprodukte entstehen, die sich in Masse, Ladung und Raumstruktur vom Ausgangsmaterial unterscheiden.

Welche Sequenzen anfällig sind

Die Geschwindigkeit hängt stark vom Nachbarn ab. Folgt auf Asparagin ein kleiner, flexibler Rest, kann sich der Succinimidring leicht bilden:

• Asn-Gly ist das mit Abstand anfälligste Motiv. In Lösung bei neutralem pH und 37 °C liegen die Halbwertszeiten solcher Stellen in Modellpeptiden im Bereich von Tagen.
• Asn-Ser und Asn-His folgen mit deutlichem Abstand.
• Sperrige Nachbarn wie Valin, Isoleucin oder Prolin bremsen die Reaktion stark.
• Glutamin deamidiert unter üblichen Bedingungen um Größenordnungen langsamer, weil der entsprechende Ring einen Kohlenstoff mehr hätte und sich schlechter bildet.

Wer eine Sequenz beurteilt, sucht deshalb zuerst nach „NG“, „NS“ und „NH“ im Einbuchstabencode. Wie man den Code liest, erklärt der Beitrag Den Einbuchstabencode einer Sequenz lesen.

Was die Geschwindigkeit steuert

Neben der Sequenz bestimmen drei äußere Größen, wie schnell ein Peptid deamidiert:

1. pH-Wert. Die Succinimidbildung beschleunigt sich mit steigendem pH. Im leicht sauren Bereich um pH 4 bis 5 ist die Deamidierung meist am langsamsten.
2. Temperatur. Wie bei den meisten chemischen Reaktionen steigt die Rate mit der Temperatur deutlich. Lagerung bei −20 °C statt Raumtemperatur macht einen erheblichen Unterschied.
3. Wasser. Im trockenen Lyophilisat ist die Beweglichkeit der Kette stark eingeschränkt und die Reaktion entsprechend langsam. Restfeuchte beschleunigt sie — ein Grund, warum der Wassergehalt nach Karl Fischer für die Haltbarkeit zählt, siehe Karl-Fischer-Titration.

Auch der Puffer spielt eine Rolle: Phosphat- und Carbonatpuffer katalysieren die Reaktion messbar. Welche Puffer sich für empfindliche Sequenzen eignen, beschreibt der Beitrag Pufferwahl für Peptidlösungen.

Nachweis in der Analytik

Deamidierung ist in der einfachen Massenmessung schwer zu erkennen: Die Masse steigt nur um 0,98 Da. Bei einem Peptid mit mehreren tausend Dalton liegt das Signal des deamidierten Produkts direkt neben dem zweiten Isotopenpeak des Ausgangsmaterials. Ohne hochauflösendes Gerät oder vorherige chromatographische Trennung geht es im Isotopenmuster unter.

Die zuverlässigsten Nachweiswege sind:

• Umkehrphasen-HPLC. Die zusätzliche Carboxylgruppe macht das Produkt meist etwas polarer. Deamidierungsprodukte erscheinen deshalb häufig als kleine Nebenpeaks kurz vor oder nach dem Hauptpeak; Isoasparaginsäure und Asparaginsäure lassen sich mit geeigneten Gradienten oft voneinander trennen.
• LC-MS. Nach der Trennung zeigt der Nebenpeak eine um 0,98 Da erhöhte Masse. Das bestätigt die Zuordnung.
• Tandem-MS. Die Fragmentierung zeigt, welcher Rest betroffen ist, wenn die Sequenz mehrere Asparagine enthält; siehe Tandem-MS.
• Ionenaustausch- und Kapillarelektrophorese. Weil sich die Ladung ändert, trennen ladungsbasierte Verfahren besonders gut; siehe Kapillarelektrophorese.

Vorbeugung im Laboralltag

Deamidierung lässt sich nicht verhindern, aber stark verlangsamen:

• Lyophilisat trocken und bei −20 °C lagern, das Behältnis erst nach dem Temperaturausgleich öffnen, damit kein Kondenswasser eindringt.
• Lösungen möglichst leicht sauer ansetzen und kalt lagern; neutrale und basische Puffer nur so kurz wie nötig verwenden.
• Aliquotieren statt eine Stammlösung über Wochen immer wieder zu entnehmen — siehe Aliquotieren statt wiederholt auftauen.
• Bei Sequenzen mit Asn-Gly-Motiv die Haltbarkeit der Lösung bewusst kurz ansetzen und im Laborjournal dokumentieren.

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