LAL-Test: Gelclot, kinetisch-chromogen und rekombinanter Faktor C

Endotoxine sind für Zellkulturversuche eine der tückischsten Verunreinigungen: Schon Spuren lösen in vielen Zelltypen starke Reaktionen aus, und diese Reaktionen lassen sich leicht mit einer Wirkung des untersuchten Peptids verwechseln. Der Standardtest dafür ist der LAL-Test. Dieser Beitrag erklärt, wie er funktioniert, welche Varianten es gibt und warum Peptide ihn stören können. Die Grundlagen zu Endotoxinen und Bioburden stehen im Beitrag Endotoxine und Bioburden.

Das Prinzip

LAL steht für Limulus-Amöbozytenlysat. Die Blutzellen des Pfeilschwanzkrebses enthalten eine Kaskade von Enzymen, die bei Kontakt mit bakteriellem Endotoxin nacheinander aktiviert werden und am Ende das Blut gerinnen lassen — ein Abwehrmechanismus des Tieres. Das Lysat dieser Zellen reagiert im Reagenzglas genauso, und zwar extrem empfindlich: Die üblichen Tests erfassen Endotoxinmengen im Bereich von Hundertstel bis Tausendstel Endotoxin-Einheiten (EU) pro Milliliter.

Das Europäische Arzneibuch beschreibt die Bestimmung bakterieller Endotoxine in einem allgemeinen Kapitel mit mehreren gleichwertigen Verfahren.

Die Varianten

Verfahren	Ablesung	Ergebnis	Typischer Einsatz
Gelclot	festes Gel im umgedrehten Röhrchen: ja oder nein	Grenztest oder halbquantitativ	einfache Freigabeprüfung, Referenzverfahren bei Streitfällen
turbidimetrisch-kinetisch	Zeit bis zu einer bestimmten Trübung	quantitativ	Routinelabore mit Plattenlesegerät
chromogen-kinetisch	Zeit bis zu einer bestimmten Farbe aus einem Farbsubstrat	quantitativ	Routinelabore, hohe Empfindlichkeit
chromogen-Endpunkt	Farbintensität nach fester Zeit	quantitativ	einfache Quantifizierung

Die kinetischen Verfahren liefern eine Standardkurve über mehrere Größenordnungen und sind heute in den meisten Laboren Standard. Der Gelclot-Test ist einfacher, dafür nur halbquantitativ.

Rekombinanter Faktor C

Das erste Enzym der Kaskade, Faktor C, lässt sich gentechnisch herstellen. Tests auf Basis des rekombinanten Faktors C (rFC) kommen ohne Lysat aus Tierblut aus und haben einen analytischen Vorteil: Das klassische Lysat enthält einen zweiten Aktivierungsweg über Faktor G, der auf β-Glucane anspricht — Zuckerpolymere aus Pilzen, Pflanzen und Cellulosematerialien. β-Glucane können deshalb im LAL-Test falsch positive Ergebnisse erzeugen. Der rFC-Test reagiert darauf nicht. Das Europäische Arzneibuch hat dem rFC-Verfahren ein eigenes Kapitel gewidmet.

Warum Peptide den Test stören können

Jede Probe kann den Test hemmen oder verstärken. Bei Peptiden gibt es dafür zwei besondere Gründe:

• Maskierung. Kationische, amphipathische Peptide lagern sich an Lipopolysaccharid an — derselbe Mechanismus, mit dem manche von ihnen in der Forschung als endotoxinbindend beschrieben werden. LL-37 ist ein Beispiel; siehe Antimikrobielle Peptide. Gebundenes Endotoxin ist für den Test teilweise unsichtbar, und das Ergebnis fällt zu niedrig aus.
• Einfluss auf die Enzyme. Peptide mit Proteasehemmwirkung oder solche, die den pH-Wert der Probe verschieben, beeinträchtigen die enzymatische Kaskade. Der Test verlangt einen pH-Wert im neutralen Bereich; saure Peptidsalze wie TFA-Salze können ihn verschieben.

Die Pflichtkontrolle: Wiederfindung

Deshalb ist jede Endotoxinmessung mit einer Positivkontrolle der Probe verbunden: Ein Teil der Probe wird mit einer bekannten Menge Endotoxin versetzt und parallel gemessen. Liegt die Wiederfindung innerhalb des vorgeschriebenen Bereichs — im Arzneibuch 50 bis 200 Prozent —, gilt der Test für diese Probe als gültig. Liegt sie außerhalb, wird die Probe weiter verdünnt, bis die Störung verschwindet, höchstens aber bis zur maximal gültigen Verdünnung, bei der der Grenzwert gerade noch nachweisbar ist.

Ein Endotoxinbefund ohne Angabe der Wiederfindung sagt deshalb bei Peptiden wenig aus.

Praxishinweise

• Nur endotoxinfreie Gefäße, Pipettenspitzen und Wasser verwenden; Glas kann bei hohen Temperaturen depyrogenisiert werden. Die Grundregeln beschreibt Endotoxinfreies Arbeiten.
• Den pH-Wert der Probenverdünnung kontrollieren.
• Bei Verdacht auf β-Glucane, etwa aus Cellulosefiltern, auf ein rFC-Verfahren ausweichen oder einen glucanblockierenden Puffer verwenden.
• Ergebnisse immer in EU pro Milligramm Peptid oder pro Milliliter mit Bezug zur eingesetzten Konzentration angeben, damit sie sich auf das Zellkulturexperiment übertragen lassen; siehe Zellkulturmodelle für Peptidforschung.

Research Use Only. Alle im Katalog geführten Materialien sind ausschließlich für die wissenschaftliche Laborforschung bestimmt und nicht zur Anwendung am oder im menschlichen oder tierischen Körper bestimmt.