Nachweis- und Bestimmungsgrenze (LOD/LOQ): was „nicht nachweisbar“ bedeutet

„Keine Verunreinigungen nachweisbar“ ist eine der beruhigendsten Formulierungen auf einem Analysezertifikat — und eine der am wenigsten aussagekräftigen, solange keine Zahl dabeisteht. Jede Methode sieht nur bis zu einer bestimmten Grenze. Dieser Beitrag erklärt, wie Nachweis- und Bestimmungsgrenze definiert sind, wie sie ermittelt werden und wie man Angaben zu Verunreinigungen richtig liest.

Zwei Grenzen, zwei Fragen

Nachweisgrenze (LOD, limit of detection). Die kleinste Menge eines Stoffes, bei der das Signal mit hinreichender Sicherheit vom Grundrauschen der Messung unterschieden werden kann. Die Frage lautet: Ist der Stoff da?

Bestimmungsgrenze (LOQ, limit of quantitation). Die kleinste Menge, die sich mit akzeptabler Richtigkeit und Präzision beziffern lässt. Die Frage lautet: Wie viel ist da?

Zwischen beiden liegt ein Bereich, in dem ein Stoff erkennbar, aber nicht zuverlässig quantifizierbar ist. Ein Signal in diesem Bereich wird korrekt als „nachgewiesen, unterhalb der Bestimmungsgrenze“ berichtet — nicht als Zahl mit zwei Nachkommastellen.

Wie die Grenzen ermittelt werden

Die Leitlinie ICH Q2 zur Validierung analytischer Methoden beschreibt mehrere gleichwertige Wege:

• Signal-Rausch-Verhältnis. Man vergleicht die Höhe eines Signals mit der Schwankung der Basislinie. Üblich ist ein Verhältnis von etwa 3 zu 1 für die Nachweisgrenze und 10 zu 1 für die Bestimmungsgrenze. Das Verfahren ist anschaulich und in der Chromatographie weit verbreitet.
• Streuung und Steigung. Aus einer Kalibrierung im niedrigen Konzentrationsbereich werden die Standardabweichung des Signals (σ) und die Steigung der Kalibriergeraden (S) bestimmt. Dann gilt näherungsweise: LOD = 3,3 · σ / S und LOQ = 10 · σ / S.
• Visuelle Bewertung, etwa bei nicht instrumentellen Verfahren.

Wichtig ist: Die Grenzen sind keine Eigenschaft eines Geräts, sondern einer Methode unter bestimmten Bedingungen — Säule, Gradient, Probenmenge, Detektorwellenlänge. Dieselbe HPLC-Anlage kann mit einer anderen Methode deutlich andere Grenzen haben. Wie die Validierung insgesamt aufgebaut ist, beschreibt Methodenvalidierung nach ICH Q2.

Was die Grenzen bei Peptiden bestimmt

Bei der HPLC-Reinheitsprüfung von Peptiden werden Verunreinigungen üblicherweise als Flächenanteil am Gesamtchromatogramm angegeben. Die erreichbaren Grenzen hängen von mehreren Faktoren ab:

• Probenmenge. Mehr aufgegebene Substanz hebt kleine Nebenpeaks über das Rauschen — bis der Hauptpeak die Säule überlädt und Nebenpeaks in seiner Flanke verschwinden.
• Detektion. Bei 214 bis 220 nm absorbieren die Peptidbindungen aller Peptide, bei 280 nm nur Tryptophan und Tyrosin. Eine Verunreinigung ohne diese Aromaten kann bei 280 nm unsichtbar sein; siehe UV-Quantifizierung bei 280 nm.
• Trennleistung. Eine Verunreinigung, die mit dem Hauptpeak zusammenfällt, hat keine Nachweisgrenze — sie ist schlicht nicht sichtbar. Hier helfen orthogonale Methoden; siehe Kapillarelektrophorese.
• Basislinie. Gradientendrift und Systempeaks erhöhen das Rauschen im relevanten Bereich; wie man eine Basislinie liest, erklärt Ein Chromatogramm lesen.

Berichtsschwellen für Verunreinigungen

Für Arzneimittel legt das Europäische Arzneibuch in seiner allgemeinen Monographie für Substanzen zur pharmazeutischen Verwendung für synthetische Peptide abgestufte Schwellen fest:

Schwelle	Wert	Bedeutung
Berichtsgrenze	0,1 %	Verunreinigungen ab diesem Anteil werden einzeln berichtet
Identifizierungsgrenze	0,5 %	ab diesem Anteil muss die Struktur aufgeklärt werden
Qualifizierungsgrenze	1,0 %	ab diesem Anteil ist die Unbedenklichkeit zu belegen

Für Forschungsmaterialien gilt dieser Rahmen nicht verbindlich. Er ist aber ein nützlicher Maßstab: Eine Methode, deren Bestimmungsgrenze oberhalb von 0,1 Prozent liegt, kann einzelne Verunreinigungen in dieser Größenordnung nicht belastbar beziffern.

So liest man Angaben zu Verunreinigungen

• „Nicht nachweisbar“ ist nur mit genannter Nachweisgrenze aussagekräftig.
• „< 0,05 %“ ist eine Aussage über die Bestimmungsgrenze der Methode, nicht über die Abwesenheit der Verunreinigung.
• Eine Summe der Verunreinigungen, die exakt zur Reinheit ergänzt, ist plausibel; eine Reinheit von 99,9 Prozent ohne Angabe, welche Nebenpeaks wie berücksichtigt wurden, lässt Fragen offen. Die typischen Nebenprodukte beschreibt Nebenpeaks im Chromatogramm.

Auf unseren Produktseiten nennen wir die Reinheitsspezifikation als Sollwert, zu dem wir einkaufen — keine chargenbezogenen Messwerte und damit auch keine Nachweisgrenzen. Wer für eine Fragestellung Verunreinigungsprofile auf Spurenebene braucht, sollte das gezielt prüfen lassen.

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